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免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）

一、實(shí)驗(yàn)原理

以（抗體和抗原）之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究（蛋白質(zhì)相互作用）的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整（細(xì)胞內(nèi)生理性）相互作用的有效方法。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。

CO-IP應(yīng)用與IP區(qū)別

1、測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合

2、確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔

CO-IP與IP只取決于檢測(cè)焦點(diǎn)是初級(jí)靶分子（抗原）還是次級(jí)靶分子（相互作用蛋白）

二、實(shí)驗(yàn)過程

1、提取蛋白。

2、在細(xì)胞裂解液中加入抗X的抗體。

3、孵育后再加入Protein A或G(于Agarose 或magnetic beads等介質(zhì)上)。

若細(xì)胞中有與興趣蛋白結(jié)合的目的蛋白，就可以形成復(fù)合物：“Y—X—抗X抗體—Protein A或G"

4、經(jīng)變性、聚丙烯酰胺凝膠電泳，復(fù)合物又被分開。（xy抗原、x抗體）。

5、western blot分析，質(zhì)譜分析。

（Protein A是一種金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，能特異性地與人和哺乳動(dòng)物抗體（主要是IgG）的Fc區(qū)結(jié)合。）

ProteinA/G的作用及原理

“捕獲”抗體，形成復(fù)合物，

抗體-目的蛋白-ProteinA/G beads 非共價(jià)健結(jié)合

ProteinA/G- beads 共價(jià)結(jié)合

三、CO-IP特征

優(yōu)點(diǎn)：

1、相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)。

2、蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響。

3、可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。

局限性：

1、可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用

2、兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，有第三者在中間起橋梁作用；

3、必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇后檢測(cè)的抗體，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果

四、實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵

1、實(shí)驗(yàn)需要注意點(diǎn)就是抗體的性質(zhì)。特別是多抗的特異性是問題。

2、為防止蛋白的分解、修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白酶抑制劑，低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3、考慮抗體/緩沖液的比例?？贵w過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。

4、確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來確定。

五、注意的問題：

1、裂解液

(1)、細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或Triton X-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗(yàn)確定。

(2)、不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的cocktail

2、免疫沉淀中抗體的選擇

3、抗體

使用對(duì)照抗體：（陰性和陽(yáng)性）

陰性：?jiǎn)慰寺】贵w：同一種屬的IgG

兔多克隆抗體：正常兔IgG

陽(yáng)性：細(xì)胞內(nèi)某種蛋白的抗體（做膜蛋白A，用膜蛋白B）

六、未檢測(cè)到目得蛋白或蛋白很少

可能原因

1、樣品被蛋白酶降解：

添加蛋白酶抑制劑；所有操作保持4℃以下冰上操作并防止凍融

2、抗體濃度太低：

調(diào)整抗體濃度，必要時(shí)設(shè)立濃度梯度，摸索較佳濃度

3、抗抗體親合力太低：

選用適合于IP和/或IB的相應(yīng)抗體

4、IP抗體未與珠子結(jié)合：

選用適合于IP的相應(yīng)珠子，正確保存防止變質(zhì)或干燥

5、Tag未暴露在融合蛋白構(gòu)象的表面：

改變tag融合表達(dá)部位

6、裂解液嚴(yán)謹(jǐn)度太高：

改用低嚴(yán)謹(jǐn)度裂解液

七、目得蛋白高背景

可能原因

1、非特異蛋白結(jié)合：

（1）在無血清培養(yǎng)液中裂解細(xì)胞；

（2）在免疫沉淀前用protein (G/A)珠子預(yù)洗，

（3）免疫沉淀后增加漂洗次數(shù)和嚴(yán)謹(jǐn)度（高鹽或去垢劑）

2、裂解液嚴(yán)謹(jǐn)度太低：

改用高嚴(yán)謹(jǐn)度裂解液。

3、實(shí)驗(yàn)儀器或液體被污染：

使用潔凈的儀器或液體。

4、轉(zhuǎn)移膜上的非特異吸附：

戴手套，用鑷子夾取，不要接觸膜轉(zhuǎn)移面。